一文盘点单基因病无创产前检测技术应用

无创产前基因检测 (Noninvasive Prenatal Test, NIPT) 是采用高通量测序技术对母体外周血中的游离DNA片段 (cfDNA) 进行测序，并将测序结果进行生信分析，从而得到胎儿的遗传信息的技术。鉴于其无创安全、准确度高的特点，ACMG、ACOG和ISPD等国际学术委员会均认为NIPT可以替代常规血清学筛查技术对21、18、13三体进行产前筛查，我国也已将NIPT广泛用于当前的产前筛查与诊断体系中。随着技术的发展和临床实践的需要，NIPT的检测范围已逐步从染色体异常向特定单基因病的检测方面发展，并成为产前筛查与诊断的热门概念。今天，小编就来带大家回顾一下单基因病无创产前检测技术的发展与应用历程。

早在2000年，日本学者Saito H就报道了基于cfDNA的无创产前检测发现软骨发育不全这一常染色体显性单基因病的案例，在孕妇外周血血浆中检出了可能来源于胎儿父亲的FGFR3基因c.1138G>A突变，并被羊水细胞测序和出生后影像学结果证实^[1]。2012年，英国遗传检测网络 (UKGTN) 批准了针对软骨发育不全和致死性骨发育不良的无创产前检测；2017年，美国和意大利推出了针对25/44种无创单基因病的检测产品；2019年，华大基因推出了多种单基因病无创产前检测，并且在与医院合作开展的临床试验中显示出了良好的准确性 (100%)。(点击了解)

与染色体疾病的检测不同，在临床应用的第一代NIPT单基因病检测是基于靶向扩增聚合酶链式反应 (PCR) 技术。随后，实时定量PCR (RT-PCR) 被引进，从而可针对性染色体连锁疾病采取不同的风险规避方式^[2]，由于需要标准曲线和胎儿分数 (FF) 量化的单独分析，该方法流程复杂，效率较低。而微滴式数字PCR (ddPCR) 方法被用来排除父源异常^[3]。它是在进行传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，从而可以实现0.01%或以上比例的突变检出，具有更高的灵敏度；可以有效区分浓度差异微小的样品，具有更高的精密度和重复性；并且不需要标准曲线或规范化，就能实现绝对定量，操作过程和结果分析简单。

华大基因于2018年发布全因2.0产品 (点击了解)，采用ddPCR技术对FGFR3基因上的两个突变位点进行分析，对软骨发育不全这一较为常见的单基因遗传病进行防控。

为了提升检测效率，靶向扩增测序技术 (PCR-NGS) 逐渐开始发展起来并应用至NIPT场景中。PCR-NGS是通过一次PCR反应同时对多个靶标进行扩增，然后进行高通量测序至>10,000 X的深度，对原始cfDNA样本库中存在的等位基因进行可视化和计数^[4]。英国国家医疗服务体系 (NHS) 已常规采用PCR-NGS来筛查胎儿中FGFR3和FGFR2复发性致病变异，或在父亲患病的情况下排除父源等位基因。然而PCR-NGS需要针对具体案例进行定制化开发，需耗费大量的人工和时间成本，限制了该技术在临床的广泛应用。

除了靶向扩增测序的方法，目前针对基因组特定区域的捕获测序可以实现对目标疾病对应基因的所有编码区进行检测。还可以采用UMI双端建库捕获测序技术 (UMI-NGS)，对常染色体显性或X染色体连锁遗传病实现更灵敏更精准的检测。研究显示，在2208名有家族史或超声异常的孕妇进行25种遗传病的检测中，阳性检出率为5.7%，包括成骨不全 (35例)、致死性骨发育不良 (21例)、软骨发育不全 (14例)、努南综合征 (26例) 等疾病；经检验，该方法的敏感性>99%，特异性>99%^[5-6]。相比于PCR技术，UMI-NGS还可以有效避免等位基因脱扣现象，通量高且灵敏度高，适合多种疾病多个位点的检测，大大提升了DNA检测的效率。

华大基因于2019年在国内率先推出多种单基因病无创产前检测产品 (点击了解)，采用目标区域捕获和双端分子标签 (UMI) 技术，针对18个基因相关的27种显性单基因遗传病进行检测，灵敏度和特异性均>99%。

以上技术主要是检测基于父系遗传突变和新发突变引起的显性单基因病，那为什么针对隐性单基因病的检测产品却难以普及呢？

其主要原因是隐性单基因遗传病的筛查需要进行相对单体型分析 (Relative Haplotype Dosage，RHDO)，也就是先对夫妇双方目标靶点周围的单核苷酸多态性 (SNP) 位点进行单倍型构建，然后对母体外周血进行测序判断等位SNP位点比率，从而判断出胎儿的基因型及来源，指导下一步干预^[4]。相比于显性单基因遗传病，隐性单基因病的无创产前检测的成本更高，操作步骤更复杂，且临床意义需结合父方基因进一步确定。目前，夫妻双方可以通过在孕前或产前进行携带者筛查，防控上百种隐性单基因病风险。

在出生缺陷二级防控的筛查层面，华大基因已具备产前针对染色体疾病和单基因遗传病的整体解决方案：NIFTY^®系列产品可对胎儿常见染色体非整倍体、92种缺失重复综合征进行检测；扩展性携带者筛查可以对夫妇隐性单基因病的携带情况进行筛查；而单基因病无创产前检测可用于胎儿显性新发单基因病的产前筛查，预防部分遗传病的首次发生，构建完备的二级预防体系。

拓展阅读：

参考文献：

[1] Saito, H., Sekizawa, A., Morimoto, T., et al (2000). Prenatal DNA diagnosis of a single-gene disorder from maternal plasma. The Lancet, 356(9236), p.1170. doi:https://doi.org/10.1016/s0140-6736(00)02767-7.

[2] Hill M, Lewis C, Jenkins L, Allen S, Elles RG, Chitty LS. Implementing noninvasive prenatal fetal sex determination using cell-free fetal DNA in the United Kingdom. Expert Opin Biol Ther 2012;12 Suppl 1:S119-26.

[3] Gruber A, Pacault M, El Khattabi LA, et al. Non-invasive prenatal diagnosis of paternally inherited disorders from maternal plasma: detection of NF1 and CFTR mutations using droplet digital PCR. Clin Chem Lab Med 2018;56:728-38.

[4] Hanson, B., Paternoster, B., Povarnitsyn, N., et al (2023). Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. [online] evcna.com. Available at: https://evcna.com/article/view/5456 [Accessed 27 Jul. 2023].

[5] Mohan, P., Lemoine, J., Trotter, C., et al (2022). Clinical experience with non‐invasive prenatal screening for single‐gene disorders. Ultrasound in Obstetrics & Gynecology, 59(1), pp.33–39. doi:https://doi.org/10.1002/uog.23756.

[6]验证数据，贝勒医学院，2016。

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